广告位招租

推扬网

 找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

搜索
推扬网 门户 你问我答 查看内容

硫酸铵沉淀法的原理及步骤

2020-7-17 17:10| 发布者: admin| 查看: 11| 评论: 0

摘要: 匿名用户的回答: 抗体的纯化 ( 硫酸铵沉淀法)一, 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋 ...

匿名用户的回答:

抗体的纯化 ( 硫酸铵沉淀法)
一, 基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二, 试剂及仪器

1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等
2. 硫酸铵( NH 4 ) SO 4
3. 饱和硫酸铵溶液( SAS )
4. 蒸馏水
5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )
6. 透析袋
7. 超速离心机
8. pH 计
9. 磁力搅拌器

三, 操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。

(一)配制饱和硫酸铵溶液( SAS )

1.将 767g ( NH 4 ) 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液( 4.1 mol/L, 25 ° C ).

2.其它不同饱和度铵溶液的配制
(二)沉淀
1.样品(如腹水) 20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片;
2.保留上清液并测量体积;
3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 (

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜( 4 ° C ),使蛋白质充分沉淀。
(三)透析
1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C )。弃上清保留沉淀;
2.将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对
PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时( 4 ° C ),每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨;
3.透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。
四,应用提示
(一) 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。
1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中,使浓度为 0.5:1 (v/v) ;
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜( 4 ° C );3.3000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C ),保留上清液;上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨;
4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨;
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效
(二)为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表 1 );硫酸氨沉淀法与层析 技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

热门推荐
最新资讯
关闭

站长推荐上一条 /1 下一条

QQ|广告服务|网站出售|投稿要求|禁言标准|版权说明|免责声明|手机版|小黑屋|推扬网 ( 粤ICP备18134897号 )|网站地图

扫码关注
接收重要通知

收粉收量信息等
将会公布在公众号上

GMT+8, 2020-10-29 09:13 , Processed in 0.309395 second(s), 30 queries .

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2017 Comsenz Inc.

返回顶部

为了响应国家互联网安全,本站已和国家网信办举报中心对接。发布内容信息系统会自动记录IP地址、设备信息、行为记录等。如有发生犯罪违法违规行为,我们全部配合有关部门协助调查取证!

本站部分文字及图片均来自于网络,如侵犯到您的权益,请及时通知我们,我们将及时的处理。

本站所提供的信息,只供参考之用。本站不保证该等信息的准确性、有效性、及时性或完整性。本站一概毋须以任何方式就任何信息传递或传送的失误、不准确或错误对用户或任何其他人士负任何直接或间接的责任。
在法律允许的范围内,本站在此声明,不承担用户或任何人士就使用或未能使用本站所提供的信息或任何链接或项目所引致的任何直接、间接、附带、从属、特殊、惩罚性或惩戒性的损害赔偿(包括但不限于收益、预期利润的损失或失去的业务未实现预期的节省)。

本站中的文章(包括转贴文章)的版权仅归原作者所有,若作者有版权声明的或文章从其它网站(或各种互联网渠道)转载而附带有原所有站的版权声明者,其版权归属以附带声明为准;文章仅代表作者本人的观点,与本站立场无关。